T细胞尼龙毛柱分离法

上海金畔生物科技有限公司提供T细胞尼龙毛柱
简单介绍
在研究体内及体外的免疫系统时,分离淋巴细胞群是一个关键步骤。因为现在市场上并没有针对B细胞的特异性抗血清,所以分离淋巴细胞中的T细胞并不是十分方便。T细胞尼龙毛分离法利用
了尼龙毛对B细胞的亲和力,从而使T细胞在没有严重损伤的情况下达到的足够的纯度。
 
T细胞尼龙毛柱分离法的详细介绍
T细胞尼龙毛柱分离法
在研究体内及体外的免疫系统时,分离淋巴细胞群是一个关键步骤。因为现在市场上并没有针对B细胞的特异性抗血清,所以分离淋巴细胞中的T细胞并不是十分方便。T细胞尼龙毛分离法利用
了尼龙毛对B细胞的亲和力,从而使T细胞在没有严重损伤的情况下达到的足够的纯度。因为这个方法不像流式和磁珠费用昂贵,而且操作简便,所需要的条件也不高,是一种非常实用的方法

(在此我向各位解释一下,现在分离T细胞的方法主要是三种,流式,磁珠法,尼龙毛法。与前两种方法相比,尼龙毛法的优势在于无需特定的设备仪器,一般的实验室均有条件操作;价格相
对低廉;可以进行大量样本操作。)
首先要指出的是实验中所使用的是分离T细胞专用的尼龙毛(Nylon Fiber),不是化工上的尼龙纤维,曾经有人问过我这种问题,如果你买错了,可是做不出来的!其次,现在市面上的尼龙毛
也是良隽不齐,也有同仁反应买到的尼龙毛加入缓冲液以后成了一团糨糊,根本没法使用,这个问题就要靠各位的慧眼了。
现在市面上有尼龙毛填料,也已经有了商品化的尼龙毛柱子,这两者的区别主要是以下两点:
1.       商品化的柱子的填料量是已经定好的,有一个确定的上样量范围。而自己买填料装柱可以控制填料量,也就是可以控制上样量,这对于样本量非常少,或是样本量非常大的实验需求
非常合适。
2.       商品化的柱子已经经过了无菌处理(一般是辐射灭菌),而自己装柱当然就要自己灭菌了。
3.       商品化的柱子在实验的重复性上有着绝对的优势。自己装的柱子在填料的处理和装柱的松紧等方面不容易控制,差异性的控制就看你的实验技巧了。
操作方法:
1.秤取1.5g尼龙毛装入20-30ml玻璃或一次性注射器内(要可以灭菌的),填料的体积控制在15毫升左右(注射器上有标记,所以还是比较好控制的),因为尼龙毛的松紧关系到T细胞的回收率,
所以要特别注意。注射器下端配接5厘米左右长的带有弹簧夹的橡皮管。
2. 加入大量的PBS平衡柱子后,用铝箔包裹,并置于适当的容器内,高压灭菌15分钟。
(商品化尼龙毛柱以上步骤可以省略,经过无菌PBS平衡后直接进行下列步骤。)
3. 灭菌的尼龙毛柱垂直固定后放于超净台内,顶部以铝箔覆盖,避免污染。
4. 橡皮管,弹簧夹用无水酒精消毒后接注射器下端,打开弹簧夹调节流速在大约3-4ml/min。
5.首先,加入3-4倍柱体的无血培养基平衡;随后,之后加入相同体积的含有血清的培养基平衡(上述培养基都要预热),最后等培养基页面接近柱填料页面时,关闭弹簧夹。
6. 样本细胞悬浮液浓度控制在5×108cells/ml的,上样量一般是1/3-1/5柱体积(商品化的柱子一般都有推荐上样量)。样品加入之后,再加入少量培养液,然后关闭弹簧夹。
7. 柱上覆盖铝箔,移置于消毒过的容器中,37℃孵育1小时。此过程中柱子必须要保持垂直状态。
8. 从培养箱中拿出柱子,置于超净台内,除去铝箔。接上按照4.中的方法消毒的弹簧夹和橡皮管,加入适当体积经37℃预热的培养基,打开弹簧夹控制流速在3-4 mL/min,流出约5ml之后,
流出的培养液基变得不透明,此时其中含有T细胞,收集这一部分培养基。
9. 基本上何时结束收集取决于流出液体中细胞的浓度,实际上,收集的量达到一个柱体积时就可以停止收集,因为即使收集更多的量,回收率几乎不会增加。
10 。参考数据:
样本:小鼠脾脏(T细胞含量在30-40%,B细胞含量在55-60%)
细胞回收率:13-25%
B细胞污染率:小于15%
 
样本:大鼠脾脏(T细胞含量在30-35%,B细胞含量在55-65%)
细胞回收率:大于25%
B细胞污染率:小于15%
 
样本:人或兔外周血
细胞回收率 : 20-30% (人);25-35% (兔)
B细胞污染率:小于5% (人、兔)
 
(注)收集粘附于尼龙毛上的细胞时,将T细胞收集完毕后的尼龙毛在无菌操作的状态下取出,转移到适当的容器中,用镊子小心的将尼龙毛松开,粘附的细胞可以洗到培养基中。或者将注射
器芯插入注射器内,通过压力使的粘附的细胞随着液体流出。
 
产品信息
品牌     品名                   规格
Wako  T细胞尼龙毛柱          0.5g*10  (推荐用于小鼠脾脏)
Wako  T细胞尼龙毛柱L型      1g*10   (推荐用于大鼠脾脏、人或兔子的外周血)
Wako  T细胞尼龙毛            2g*5   (可按照自己的需要装柱,控制上样量)
Wako  小鼠淋巴细胞分离试剂  30mL*5  用于从小鼠脾脏,淋巴结,淋巴结悬浮液中分离淋巴细胞
Wako  人淋巴细胞分离试剂  100ml*6  用于从人血中提取淋巴细胞
Wako  铁粉(羰基铁)Iron Powder, from Iron Carbonyl  25g   直径25um,用于清除巨噬细胞
Wako  κ-卡拉胶κ-Carrageenan  25g
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