T4 DNA Ligase

T4 DNA Ligase描述来源浓度使用方法储存/保存方法技术指标注意事项

产品描述
描述
在有Mg2+和ATP存在的条件下,T4 DNA Ligase能催化双链 DNA或RNA上相邻的5´-磷酸末端和3´-羟基末端形成磷酸二酯键。该酶不仅能够催化双链DNA的平末端或粘性末端之间的连接,还可以修复双链 DNA、RNA 或 DNA/RNA 杂交双链中的单链切刻,但不能催化单链 DNA 之间的连接。
产品组成:

组成 500U 500U×10
T4  DNA Ligase (5U/uL) 500U 500U×10
5×T4 DNA Ligation Buffer 400uL 400uL×10

酶储存缓冲液:
10 mM Tris-HCl (pH 7.5) ,50mM KCl,1mM DTT, 0.1mM EDTA,50% (v/v) glycerol。
5 × T4 DNA Ligase Buffer
250 mMTris-HCl (pH 7.5), 50mM MgCl2,50mM DTT, 5mM ATP,连接促进剂。

来源
纯化于携带T4 DNA ligase 基因 的E. coli 菌株。
浓度
5U/uL
使用方法
连接反应体系:
1、在一个无菌0.2mL的PCR管中加入以下成分 

成分 体积
5×T4 DNA Ligase Buffer 2uL
载体(50-100ng/uL) XuL
片段 YuL
T4 DNA Ligase (5U/uL) 1uL
灭菌水 补至10uL

用手指轻弹管底混匀各成分,离心数秒使反应混合物沉到管底。
2、反应条件
粘性末端连接:25℃反应5-10分钟。
平末端连接或者一个平端另一个为粘端的连接:25℃反应30-60分钟。
3、连接载体和片段的使用量
连接载体和片段的量一般按照摩尔比 1:3-1:10 进行,片段使用量比载体使用量大,载体和片段的使用量一般为 50-100ng 之间。
例如,3kb 的载体和 0.5kb 片段按摩尔比 1:3 的连接反应。假如使用 50ng 的 3kb 载体,那么 0.5kb 的片段需要量计算方法为:[(50ng×0.5kb)÷3kb]×(3÷1)=25ng
4、转化
连接完成后,取 5-10uL连接产物加到合适的感受态细胞中,按照感受态细胞说明书中所叙述的转化步骤进行转化。连接反应结束后不能转化时,可将连接产物置于-20℃冰箱中保存。

储存/保存方法
-20℃保存,有效期12个月。
技术指标

抑制剂和热失活:
大于200mM的NaCl或KCl可以强烈抑制连接酶活性。65℃加热 10分钟或70℃加热5分钟即可失活。
单位定义:
在37℃,20分钟内交换1 nmole 的32PPi所需要的酶量定义为一个Weiss单位。本产品酶1U(Weiss Unit)相当于200个粘性末端单位。在T4 DNA 连接酶反应缓冲液中,16℃条件下,30分钟能够使50%的经Hind III消化的λDNA 片段连接所需要的酶量为一个粘性末端单位。

质量控制:
蓝白斑分析实验表明白斑数小于2%;过量T4 DNA Ligase 混合超螺旋质粒检测实验表明无核酸酶检出;SDS-PAGE检测重组蛋白纯度大于99%。

注意事项
1、化冻 5×T4 DNA Ligase Buffer 后,需要混匀后再使用。
2、T4 DNA Ligase 最适活性温度为 37℃,但是高温连接形成的连接产物的转化效率会大大降低,所以选用 25℃或 16℃等稍低的连接温度。如果连接产物不用转化且需要高的连接效果,可以在 37℃条件下进行。
3、该酶需要 Mg2+为激活剂,因此螯合 Mg2+的 EDTA 的存在会阻碍连接反应。溶解于高浓度 EDTA 缓冲液的 DNA 需要用灭菌水或 TE 缓冲液进行置换。