EdU(5-ethynyl-2′ -deoxyuridine)，中文名为 5-乙炔基-2′ -脱氧尿苷，是一种胸腺嘧啶核苷类似物，其炔羟基团在天然化合物中很少见，在细胞增殖时能够替代胸苷(胸腺嘧啶脱氧核苷，thymidine) 插入正在复制的 DNA 分子中， EdU 上的乙炔基能与荧光标记的小分子叠氮化物探针(如 Azide Alexa Fluor 488 等)通过一价铜离子催化发生共价反应，形成稳定的三唑环，该反应非常迅速，被称作点击反应(Clickreaction)，从而可以进行高效快速的检测细胞增殖，特别是可以有效地检测处于 S 期的细胞百分数。与传统的免疫荧光染色(BrdU)检测方法相比， EdU 只有 BrdU 抗体大小的 1/500，在细胞内更容易扩散，不需要严格的样品变性(酸解、热解、酶解)处理，有效地避免了样品损伤，有助于在组织、器官的整体水平 上观测细胞增殖的真实情况，具有更高的灵敏度和更快的检测速度。

编号	名称	规格	保存
1	PB	120mlL	-20℃
2	AC	1.7g	-20℃
3	CU	4.4mL	-20℃
4	488原色	550μL	-20℃
5	100mg/mL EdU 母液	100μL	-20℃
6	DAPI（100×）	1.2ml	-20℃

注：AC为粉剂，使用之前需要加入10mL纯水，充分溶解之后再使用，AC容易氧化失效，分装后于冰箱-20度保存，如发现变色，需更换新鲜试剂。动物实验时物质量浓度100mM EdU母液对应质量浓度为25mg/mL，应根据用量进行换算。

实验前须知：
1、对应动物实验，EdU 建议初始给药量为 50mg/kg（50μg/g），稀释浓度为 0.5-1mg/mL。小鼠体重20g，需要注射1mg，以1mg/mL计算，需要注射1mL。
2、对于细胞实验， 推荐的EdU工作浓度为10μM,对于体外培养细胞，具体EdU使用浓度、孵育时间随样品以及研究目的的不同，可进行适当调整。
3、本试剂盒可进行大约200T的6孔板EdU实验，大约2000T的96孔板或者石蜡切片的EdU实验，实验过程中应根据样本情况来计算使用量。
一、样本处理
1、动物实验 
（1）动物 EdU 注射 
        对于小鼠，可以按照 10-200mg/kg 的用量，把 EdU 用 PBS 配制成一定浓度，腹腔注射、特定组织或器官局部注射或者加入饮用水中。具体用量跟所用动物的种类、体重和使用方式有关，可以参考相关文献，因此初次使用时建议对 EdU 的使用浓度进行一定的摸索，或者直接使用 50mg/kg 的浓度进行测试。 
        注射方式：依据客户实验而定，如腹腔注射，皮下注射，肌肉注射，尾静脉注射等，其中以腹腔注射为多。 
        6 小时后或根据特定实验确定适当的时间后，快速处死小鼠，取出所需组织，按照常规步骤制作冰冻切片或石蜡切片。EdU 标记的时候也可参考相关文献自行调整。 
        建议任何实验均可取小肠组织检测细胞增殖情况，小肠上皮组织细胞增殖快，成年小鼠 EdU 注射 6 小时后即可检测到阳性信息，可用作阳性对照进行预实验。 
（2）切片处理 
        切片前处理：组织器官最好进行清洗，以去除血液、组织中残留的 EdU，降低背景。 
        切片厚度：3-10μm 为宜，切片过厚可能会影响切片背景及染色效率。 
        切片后处理： 
        石蜡切片脱蜡：二甲苯脱蜡 2 次，15 分钟/次，梯度乙醇（100%，95%，85%，75%）各一次，5 分钟/次，去离子水洗脱 1 次。
        冰冻切片处理：室温放置 30 分钟后，固定 10 分钟，PBS 清洗 3 次，每次 5 分钟。 
2、细胞实验 
（1）细胞 EdU 标记 
        ①用细胞完全培养基和 EdU 母液按 2000：1 的比例稀释，制备适量 100μM 的 EdU 培养基； 
        ②每孔加入适量 10μM 的 EdU培养基孵育 2 小时，弃培养基（最佳孵育时间一般为细胞周期的 1/10）,EdU培养基和 EdU 反应液孵育体积可参考下表； 
        ③PBS 清洗细胞 3 次，每次 5 分钟

	96孔板	48孔板	24孔板	12孔板	6孔板	5.5cm小皿
EdU培养基	50μL	70μL	100μL	200μL	500μL	1mL
EdU反应液	50μL	70μL	100μL	200μL	500μL	1mL

（2）细胞固定通透 
     ①每孔加入细胞固定液（含 4%的多聚甲醛的 PBS）室温孵育 15 分钟，弃固定液，PBS 清洗 3 次，每次 5 分钟； 
     ②每孔加入渗透剂(0.5% TritonX-100 的 PBS)脱色摇床孵育 15 分钟；PBS 清洗 3 次，每次 5 分钟。
二、EdU 反应 

成分	使用量
PB	855μL
CU	40μL
AC	100μL
488原色	5μL
反应液总体积	1000μL

按照 PB：CU：AC：488 色原=855：40：100：5 的比列配制 EdU 反应液（反应液现配现用）。 
每个样本滴加 50-500μL 的 EdU 染色反应液（反应液均匀覆盖样本），室温避光孵育 15-60 分钟，弃染色反应液，PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。 
三、DAPI 染色 
DAPI(100x)用PBS按照1：100的比例稀释成即用型DAPI染色液，每个样本加入50-500μL DAPI染色液，避光染色15分钟，PBS清洗3次，每次5分钟。
四、图像拍照 
染色完成后建议立刻观察，使用荧光显微镜、共聚焦显微镜或者全片扫描仪进行采集图像，染色完玻片避光 4℃保存。

以上是 50mg/kg 标记小鼠 6 小时的染色图像

-20℃，有效期12个月。