EdU-647 细胞增殖检测试剂盒

EdU-647 细胞增殖检测试剂盒描述使用方法储存/保存方法

产品描述
描述
EdU(5-ethynyl-2′ -deoxyuridine),中文名为 5-乙炔基-2′ -脱氧尿苷,是一种胸腺嘧啶核苷类似物,其炔羟基团在天然化合物中很少见,在细胞增殖时能够替代胸苷(胸腺嘧啶脱氧核苷,thymidine) 插入正在复制的 DNA 分子中, EdU 上的乙炔基能与荧光标记的小分子叠氮化物探针(如 Azide Alexa Fluor 488 等)通过一价铜离子催化发生共价反应,形成稳定的三唑环,该反应非常迅速,被称作点击反应(Clickreaction),从而可以进行高效快速的检测细胞增殖,特别是可以有效地检测处于 S 期的细胞百分数。与传统的免疫荧光染色(BrdU)检测方法相比, EdU 只有 BrdU 抗体大小的 1/500,在细胞内更容易扩散,不需要严格的样品变性(酸解、热解、酶解)处理,有效地避免了样品损伤,有助于在组织、器官的整体水平 上观测细胞增殖的真实情况,具有更高的灵敏度和更快的检测速度。

编号 名称 规格 保存
1 PB 120mlL -20℃
2 AC 1.7g -20℃
3 CU 4.4mL -20℃
4 647原色 550μL -20℃
5 100mg/mL EdU 母液 100μL -20℃
6 DAPI(100×) 1.2mL -20℃

注:AC为粉剂,使用之前需要加入10mL纯水,充分溶解之后再使用,AC容易氧化失效,分装后于冰箱-20度保存,如发现变色,需更换新鲜试剂。动物实验时物质量浓度100mM EdU母液对应质量浓度为25mg/mL,应根据用量进行换算。

使用方法
实验前须知
1、对应动物实验,EdU 建议初始给药量为 50mg/kg(50μg/g),稀释浓度为 0.5-1mg/mL。小鼠体重20g,需要注射1mg,以1mg/mL计算,需要注射1mL。
2、对于细胞实验, 推荐的EdU工作浓度为10μM,对于体外培养细胞,具体EdU使用浓度、孵育时间随样品以及研究目的的不同,可进行适当调整。
3、本试剂盒可进行大约200T的6孔板EdU实验,大约2000T96孔板或者石蜡切片的EdU实验,实验过程中应根据样本情况来计算使用量。
一、样本处理 
1、动物实验 
(1)动物 EdU 注射 
        对于小鼠,可以按照 10-200mg/kg 的用量,把 EdU 用 PBS 配制成一定浓度,腹腔注射、特定组织或器官局部注射或者加入饮用水中。具体用量跟所用动物的种类、体重和使用方式有关,可以参考相关文献,因此初次使用时建议对 EdU 的使用浓度进行一定的摸索,或者直接使用 50mg/kg 的浓度进行测试。 
        注射方式:依据客户实验而定,如腹腔注射,皮下注射,肌肉注射,尾静脉注射等,其中以腹腔注射为多。 
        6 小时后或根据特定实验确定适当的时间后,快速处死小鼠,取出所需组织,按照常规步骤制作冰冻切片或石蜡切片。EdU 标记的时候也可参考相关文献自行调整。 
        建议任何实验均可取小肠组织检测细胞增殖情况,小肠上皮组织细胞增殖快,成年小鼠 EdU 注射 6 小时后即可检测到阳性信息,可用作阳性对照进行预实验。 
(2)切片处理 
        切片前处理:组织器官最好进行清洗,以去除血液、组织中残留的 EdU,降低背景。 
        切片厚度:3-10μm 为宜,切片过厚可能会影响切片背景及染色效率。 
        切片后处理: 
        石蜡切片脱蜡:二甲苯脱蜡 2 次,15 分钟/次,梯度乙醇(100%,95%,85%,75%)各一次,5 分钟/次,去离子水洗脱 1 次。
        冰冻切片处理:室温放置 30 分钟后,固定 10 分钟,PBS 清洗 3 次,每次 5 分钟。 
2、细胞实验 
(1)细胞 EdU 标记 
        ①用细胞完全培养基和 EdU 母液按 2000:1 的比例稀释,制备适量 10μM 的 EdU 培养基; 
        ②每孔加入适量 10μM 的 EdU培养基孵育 2 小时,弃培养基(最佳孵育时间一般为细胞周期的 1/10),EdU培养基和 EdU 反应液孵育体积可参考下表; 
        ③PBS 清洗细胞 3 次,每次 5 分钟

  96孔板 48孔板 24孔板 12孔板 6孔板 5.5cm小皿
EdU培养基 50μL 70μL 100μL 200μL 500μL 1mL
EdU反应液 50μL 70μL 100μL 200μL 500μL 1mL

(2)细胞固定通透 
     ①每孔加入细胞固定液(含 4%的多聚甲醛的 PBS)室温孵育 15 分钟,弃固定液,PBS 清洗 3 次,每次 5 分钟; 
     ②每孔加入渗透剂(0.5% TritonX-100 的 PBS)脱色摇床孵育 15 分钟;PBS 清洗 3 次,每次 5 分钟。
二、EdU 反应 

成分 使用量
PB 855μL
CU 40μL
AC 100μL
647原色 5μL
反应液总体积 1000μL

按照 PB:CU:AC:647 色原=855:40:100:5 的比列配制 EdU 反应液(反应液现配现用)。 
每个样本滴加 50-500μL 的 EdU 染色反应液(反应液均匀覆盖样本),室温避光孵育 15-60 分钟,弃染色反应液,PBS 冲洗 3 次,每次 5 分钟。 
三、DAPI 染色 
DAPI(100x)用PBS按照1:100的比例稀释成即用型DAPI染色液,每个样本加入50-500μL DAPI染色液,避光染色15分钟,PBS清洗3次,每次5分钟。 
四、图像拍照 
染色完成后建议立刻观察,使用荧光显微镜、共聚焦显微镜或者全片扫描仪进行采集图像,染色完玻片避光 4℃保存。
EdU-647 细胞增殖检测试剂盒
以上是 50mg/kg 标记小鼠 12 小时的染色图像

基本信息
储存/保存方法
-20℃,有效期12个月。