Hoechst33342/PI细胞凋亡染色试剂盒

产品简介：

Hoechst33342/PI细胞凋亡染色试剂盒(Hoechst 33342/PI Apoptotis Assay Kit)是一种采用Hoechst 33342和碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)双荧光染色方法进行细胞周期与细胞坏死分析的检测试剂盒。单纯的PI染色能够观察DNA直方图上凋亡细胞的亚G1峰，但只能代表G0/G1期发生凋亡，无法观察S期和G2期发生的细胞凋亡，而且细胞经过固定后无法对活细胞和死细胞进行区分。Hoechst 33342可以穿透细胞膜，进入正常细胞和凋亡细胞与DNA结合，能在紫外线下显示蓝色荧光，而且染色后凋亡细胞荧光会比正常细胞明显增强。PI不能穿透细胞膜，对于具有完整细胞膜的正常细胞或凋亡细胞不能染色。而对于坏死细胞，其细胞膜的完整性丧失，PI可以穿透细胞膜使坏死细胞着色产生红色荧光。

Hoechst 33342/PI双染后，可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。在二元直方图上，正常细胞对Hoechst33342具有拒染性，呈弱蓝色荧光＋弱红色荧光(Hoechst 33342+/PI+)；凋亡细胞对Hoechst33342具有嗜染性呈强蓝色荧光+弱红色荧光(Hoechst 33342++/PI+)；坏死细胞对PI具有嗜染性，呈弱蓝色荧光＋强红色荧光。本试剂盒亦可用荧光显微镜进行观察，检测细胞含量范围一般为0.1～1×106之间。

 

产品组成：

编号 名称	D0820 100T	Storage
试剂(A): Cell Stain Buffer(2×)	100ml	4℃
试剂(B): Hoechst 33342 Stain	0.5ml	-20℃ 避光
试剂(C): PI Stain	0.5ml	-20℃ 避光
使用说明书	1份

 

自备材料：

1.胰蛋白酶消化液

2.流式细胞仪或荧光显微镜

3.PBS

4.细胞计数板

染色结果：在蓝色荧光对红色荧光的散点图上，正常细胞呈低蓝光/低红光，凋亡细胞呈高蓝光/低红光，坏死细胞呈低蓝光/高红光。

操作步骤(仅供参考)：
1、细胞样品的制备：
⑴贴壁细胞： 
①小心收集细胞培养液到一个无菌离心管内备用。
②用胰蛋白酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹 打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。
③收集上述细胞悬液到离心管内。
④4℃，1000g 离心 3～5min，使细胞沉到管底。小心吸取上清并丢弃，可留大约 50ul 培养液，以免吸走 细胞。
⑤加入约 1ml 提前预冷的 PBS，重悬细胞，并转移至 1.5ml 无菌离心管。
⑥4℃，1000g 离心 3～5min，使细胞沉到管底。
⑦小心吸取上清并丢弃，可留大约 50ulPBS，以免吸走细胞。
⑧轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
⑵悬浮细胞： 
①4℃，1000g 离心 3～5min，使细胞沉到管底。 
②小心吸取上清并丢弃，可留大约 50ul 培养液，以免吸走细胞。 
③加入约 1ml 提前预冷的 PBS，重悬细胞，并转移至 1.5ml 无菌离心管。
④4℃，1000g 离心 3～5min，使细胞沉到管底。 
⑤小心吸取上清并丢弃，可留大约 50ul PBS，以免吸走细胞。
⑥轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。 
2、Cell Stain Buffer 工作液的配制：取适量 Cell Stain Buffer(2×)与无菌去离子水或蒸馏水等比例 混合，即为 Cell Stain Buffer 工作液。
3、重悬细胞：取上述收集好的 0.1～1×106个细胞，加入 0.9ml Cell Stain Buffer 工作液，重悬细胞沉 淀。
4、Hoechst 33342/PI 染色： 
⑴一步法：
① 加入 5μl Hoechst 33342 Stain。
② 加入 5μl PI Stain。
③ 轻轻混匀，置于冰浴或 4℃，孵育 20～30min。
⑵两步法：
① 加入 5μl Hoechst 33342 Stain，置于 37℃水浴，孵育 5～15min 
② 置于冰水中冷却后，4℃ 1000g 离心 3～5min，使细胞沉到管底，弃上层染色液。
③ 加入 0.9ml Cell Stain Buffer 工作液，重悬细胞沉淀。 
④ 加入 5μl PI Stain，置于冰浴或 4℃，孵育 5～15min。 
⑤ 轻轻混匀， 置于冰浴或 4℃，孵育 20～30min。 
5、检测并分析：用流式细胞仪在激发波长 400～500nm 检测蓝色荧光，在大于 630nm 处检测红色荧光，同 时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞 DNA 含量分析和光散射 分析。如果使用荧光显微镜检测， 检测前 4℃ 1000g 离心 3～5min 沉淀细胞，用 PBS 洗 涤一次，再涂片观察红色荧光和蓝色荧光。对于 贴壁细胞使用荧光显微镜检测，亦可不收集 细胞，弃培养液后直接依次按照上述比例加入试剂(A)、试剂 (B)、试剂(C)，冰浴或 4℃染色 20～30min。染色后 PBS 洗涤一次，再在荧光显微镜下观察。 

注意事项：

1.荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽快检测。

2.在为了获得细胞沉淀的离心的过程中，对于特殊细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当提高离心力或延长离心时间。

3.Heochst 33342与细胞孵育的时间不宜过长，一般控制在20min以内。太长容易引起Heochst 33342的发射光谱由蓝光向红光迁移，导致红色荧光与兰色荧光的比例改变。

4.如果用于组织的细胞周期与细胞凋亡检测，则必须把组织消化后，制备成单细胞悬液，才可以进行检测

5.PI对人体有一定刺激性，请注意适当防护。

6.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

 

有效期： 12个月有效。4℃保存，5～6个月有效。